Hippuricase [HIPⅡ] (T-249)

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(Diagnostic Reagent Grade) Nagase Diagnostics ENZYMES T-249REACH compliant product

Hippuricase [HIPⅡ]

from Microorganism
（Hippurate hydrolase, EC 3.5.1.32）

p ‒ Hydroxybenzoylglycine → p -Hydroxybenzoic acid + Glycine

Preparation and Specification

Appearance
: White to pale brownish lyophilizate
Specific activity
: More than 80 U/mg solid

Properties

Michaelis constants
: 2.7 × 10-3M(p -Hydroxybenzoyl glycine)
Optimum pH
: See Figure 1
pH stability
: See Figure 2
Optimum temperature
: See Figure 3
Thermal stability
: See Figure 4

Applications for Diagnostic Test

This enzyme is useful for enzymatic quantification of angiotensin-converting enzyme (ACE). HC-ANC Ⅱ (T-256) is also available as a calibrator for ACE test.

Fig.1 Optimum pH

Fig.2 pH Stability

Fig.3 Optimum temperature

Fig.4 Thermal stability

Assay

Principle

  1. The assay is based on the enzymatic hydrolysis of p -hydroxybenzoylglycine to produce p -hydroxybenzoic acid, followed by oxidative coupling to form a quinoneimine dye. The produced quinoneimine dye is measured spectrophotometrically at 505 nm

 HIP Ⅱ
p -Hydroxybenzoylglycine →p -Hydroxybenzoic acid
+ Glycine  
  NaIO4
p -Hydroxybenzoic acid + 4-Aminoantipyrine →
Quinoneimine dye
Unit definition

  1. One unit is defined as the amount of enzyme that produces 1 μ mol of p -hydroxybenzoic acid per minute at 37°C under the conditions specified in the assay procedure.

Reagents
  1. Reaction mixture
    Dissolve 742 mg of boric acid and 4.09 g of NaCl in 80 mL of purified water. Adjust the pH to 8.3 (25°C) with 4N NaOH, then make up the volume to 100 mL with purified water (borate buffer). Dissolve 195 mg of p -hydroxybenzoyl glycine in the borate buffer, then adjust the pH to 8.3 (25°C) with 4 N NaOH. Add 25 mg of 4-Aminoantipyrine (4-AA) to this solution and dissolve, then make up the volume to 50 mL with the borate buffer.
  2. Stopping & coloring agent
    Dissolve 112 mg of EDTA and 0.2 g of Triton X-100 in purified water and make up the total volume to 100 mL.
    Immediately before use, add 139 mg of NaIO₄ to 100 mL of this solution and dissolve.
  3. Enzyme dilution buffer
    0.12 M borate-NaOH buffer (pH 8.3) containing 0.7M NaCl and 0.1% BSA
  4. Reagents
    Boric acid: FUJIFILM Wako Pure Chemical #021-02195
    4-Hydroxy-hippuric acid: Bachem AG #4005059.0001
    4-AA: NACALAI TESQUE #01907-52
    Triton X-100: Dow Chemical
    NaIO4: FUJIFILM Wako Pure Chemical #197-02402
    EDTA: KISHIDA CHEMICAL #060-29133
    NaCl: FUJIFILM Wako Pure Chemical #191-01665
    BSA: Milipore #81-053
Enzyme solution

  1. Accurately weigh about 10 mg of the sample and add enzyme dilution buffer to make a total of 10 ml. Dilute it with enzyme dilution buffer to adjust the concentration as required.

Procedure
  1. Pipette 0.50 mL of reaction mixture into a test tube and preincubate at 37℃.
  2. After 5 min, add 50 μ L of enzyme solution to start the reaction at 37℃.
    ※In the case of a test blank, add 0.50 μ L of enzyme dilution buffer in place of enzyme solution.
  3. Incubate at 37oC for 10 minutes. Add 1.50 mL stop/color reagent and mix at 37℃.
  4. Measure absorbance at 505 nm.
  5. Absorbance sample :As
    blank :Ab
    △ A = As − Ab ≤ 0.400
Calculation
  1. Activity（U/mg of powder）= {(△A/10)/(12)} × (2.05/0.05) × (1/x) × (1.5)
    12 :molar extinction coefficient of quinoneimine at 505 nm（cm2/ μmole）
    10 :reaction time（min）
    2.05 :final volume（ml）
    0.05 :volume of enzyme solution（ml）
    X :concentration of the sample in enzyme solution
    （ mg/ml）
    1.5correction factor

HIP Ⅱ活性測定法（Japanese）

試薬液
  1. 反応試薬混合液
    ホウ酸742 mg およびNaCl 4.09 g を精製水80 mLに溶解する。4N NaOH を用いてpH を8.3（25℃）に調整した後、精製水で全量を100 mL とする（ホウ酸緩衝液）。このホウ酸緩衝液にp - ヒドロキシベンゾイルグリシン195 mg を溶解し、4N NaOH で pH を8.3（25℃）に調整する。続いて4-AA 25 mgを加えて溶解し、ホウ酸緩衝液で全量50 mL とする。
  2. 反応停止・呈色試薬
    EDTA 112 mg およびTriton X-100 0.2 g を精製水に溶解し、全量を100 mL とする。使用直前に、この溶液100 mL に対してNaIO₄ 139 mg を加え、溶解する。
  3. 酵素溶解希釈用液
    0.1% BSA を含むホウ酸緩衝液
  4. 試薬
    ホウ酸: 富士フイルム和光純薬製 #021-02195
    4-Hydroxy-hippuric acid: Bachem AG #4005059.0001
    4-AA: ナカライテスク #01907-52
    Triton X-100: Dow Chemical
    NaIO4: 富士フイルム和光純薬製 #197-02402
    EDTA: キシダ化学 #060-29133
    NaCl: 富士フイルム和光純薬製 #191-01665
    BSA: Milipore #81-053
酵素試料液
  1. 検品約10mg を精密に量り、酵素溶解希釈用液に溶解して全容10ml とする。
    その液を酵素溶解希釈用液で適切な濃度へと適宜希釈する。
測定操作法
  1. 試験管に反応試薬混合液0.50 mL を分注し、37℃で予備加温する。
  2. 5 分経過後、酵素試料液50 μ L を加えて混和し、37℃で反応を開始する。
    ※盲検は、酵素試料液の代わりに酵素溶解希釈用液0.50 mL を加える。
  3. 37℃で10 分間反応させる。その後、停止・呈色試薬1.50 mL を加え、37℃で混合する。
  4. 505 nm における吸光度を測定する。
    求められた吸光度を試料液はAs、盲検液はAb とする。
    Δ A = As − Ab ≦ 0.400
計算
活性（U/mg）= {(ΔA/10)/(12)} × (2.05/0.05) × (1/x) × 1.5
12 :505 nm におけるキノンイミンのモル吸光係数
（cm2 /μmole）
10 :反応時間（min）
2.05 :反応総液量（ml）
0.05 :反応に供した酵素試料液量（ml）
X :酵素試料液中の検品濃度（mg/ml）
1.5補正係数
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